CIRROSIS (ANALISIS DE LA PCR)
El análisis de
la PCR se realizó en 24 pacientes con Hepatitis C Crónica, utilizando criterios
de inclusión como: presencia de ARN-VHC en sangre diagnosticada por ELISA) y
confirmada por Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP).
TOMA DE LA
MUESTRA: 5 ml de saliva no estimulada fue obtenida de cada uno de los pacientes
escupiendo directamente dentro del tubo y mantenidas a -70°C hasta el momento
de su procesamiento.
TRANSCRIPCIÓN
REVERSA Y REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (RCP): El ARN fué extraído de la
saliva usando precipitación con cloroformo-isopropanol. El cADN fue sintetizado
por transcripción reversa en una mezcla que contenía el ácido nucleico, 500µl
de inhibidor de ARNasa, 50 µM de cada dNTP, 5 pmol del primer CA:
CAACACTACTCGGCTAGCAGT (nucleótidos 229-329) (26), 4µl de buffer de
transcripción reversa (BRL) y 20 U de transcriptasa reversa M-MLV (BRL).
Posteriormente
se realizó la RCP con 10 µl de esta muestra en una solución que contenía 50 mM
KCl, 10 mM Tris HCl pH 8,3, 2mM Mgcl2, 200µM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP,
dUTP), 10 pmol de los iniciadores C3: GGC-GACACTCCACCATAGAT (nucleótidos 1-20)
(26) y C4. Se realizaron 35 ciclos (90 seg, 94°C/2min, 40°C/2min, 68°C) en un
termociclador , usando 2 U Taq polimerasa. El producto final amplificado, fue
separado por electroforesis en geles de agarosa al 2%, y coloreados con bromuro
de etidio para su visualización bajo luz ultravioleta, para apreciar las bandas
correspondientes.
De las muestras
analizadas por TR-RCP, se obtuvo que de las 24 muestras de saliva estudiadas,
7/24 (29%) fueron positivas para la presencia del genoma viral, mientras que
17/24 (71%) fueron negativas. Con respecto a la edad se detectó a 7 pacientes
con genoma de VHC, el 57 (4/7) se ubicó en el rango de edad entre 34-55 años,
seguido por el 43% (3//) entre 56-67 años. Referente al sexo, del total de los
pacientes a los que se les detectó la presencia del genoma viral, 71% (5/7)
pertenecían al género masculino, y el 29% (2/) al género femenino, en contraste
con los pacientes negativos para el agente viral, de los cuales, el 41% ( 7/17)
fueron del género masculino, y el resto, 59% (10/17) al femenino.
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